Optische Analytik der extrazellulären Matrix-Produktion von Zell-besiedelten Scaffolds

Das zentrale Dogma des Tissue Engineering besteht in der Besiedlung biokompatibler künstlich hergestellter Gewebegerüste (sogenannte „Scaffolds“) mit Zellen, welche in das Gerüst einwachsen, bei biodegradierbaren Gerüsten das Material abbauen und durch eine natürliche Gewebematrix ersetzen, die von den Zellen selbst gebildet wird (s. Abbildung, A). Diese Gewebematrix besteht v.a. aus Kollagenen, Elastinen und weiteren extrazellulären Stützproteinen, welche die Zellen im zu bildenden Gewebe verankern. Verfahrenstechnisch ist die Optimierung dieser Matrix-Produktion eine primäre Herausforderung, da nur korrekt verankerte Zellen im neuen Gewebe ihre optimale Funktion und biomechanische Stabilität entfalten können. Daher sind readouts, welche quasi das Innere dieser Scaffolds bis in deren Schnittstelle mit den Zellen diese Matrixproduktion beurteilen können, von höchstem Interesse. Extrazelluläre Matrixproteine können immunoptisch oder biochemisch nachgewiesen werden, dabei wird häufig jedoch das Konstrukt durch Fixierung arretiert und ist nicht mehr vital. Wir benutzen Multiphotonen-Mikroskopie, um einen intrinsischen physikalischen Effekt von Kollagen-I-Proteinen auszunutzen, die Frequenzverdopplung. Hierbei wird hochenergetisches infrarotes Licht in die Probe eingestrahlt und Licht der doppelten Frequenz (halbe Wellenlänge) durch optische Filter in Rückwärtsrichtung wieder detektiert, was spezifisch auf gebildetes Kollagen hinweist (s. Abbildung, B). Durch das „optische Schneiden“ der Probe mit minimaler Invasivität können wir das dreidimensionale Netzwerk der Matrixbildung beurteilen und verfahrenstechnisch optimieren. Insbesondere die Optimierung der Umgebungs- und Milieu-Bedingungen stehen hier im Vordergrund. Wir untersuchen, welche Zusatzfaktoren zu Zellkulturmedium in dreidimensionalen Scaffolds die Matrixproduktion begünstigen. So fanden wir in aktuellen Studien deutlich stärkere Kollagenfibrillenbildung unter Bedingungen reduzierter Serumsupplemente und mit Ascorbinsäure-Supplementation (s. Abbildung, C).

Muscle Biomechanics

Abbildung: Gewebematrix-Bildung zell-besiedelter künstlicher Scaffolds und minimal-invasive optische Messtechnik zur verfahrenstechnischen Optimierung. A, zentrales Dogma des Tissue Engineering, bei dem aus biodegradierbaren, künstlich hergestellten 3D-Scaffolds gegebener Porosität, Zellen (i.d.R. Stammzellen) zur Besidelung aufgebracht werden. Diese wandern in das Scaffold ein, proliferieren und bauen die Scaffold-Komponenten ab. Dabei wird das Scaffold durch zelleigene Extrazellulärmatrix ersetzt. B, Extrazellulärmatrix-(ECM)-Komponenten, insbesondere das Kollagen Typ I können nicht-invasiv in der Tiefe der Scaffolds durch Multiphotonen-Mikroskopie unter Ausnutzung des Frequenzverdopplungseffektes (Second Harmonic Generation) label-frei dargestellt werden. C, Ergebnisse der verfahrenstechnischen Optimierung der Matrixproduktion in 3D Stammzell-Pellets. Unter Serum-Reduktion (1%, 0% FBS) und Ascorbinsäure-Supplementation (aa) finden sich die besten Ergebnisse bzgl. Fibrillenbildung und Ausrichtung der ECM (aus Vielreicher et al. 2015).

Literatur:

Vielreicher M, Schürmann S, Detsch R; Schmidt MA, Buttgereit A, Boccaccini A, Friedrich O (2013) Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface 10(86):20130263.

Vielreicher M, Gellner M, Rottensteiner U, Horch RE, Arkudas A, Friedrich O (2015) Multiphoton microscopy analysis of extracellular collagen I network formation by mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med, in press.